石正丽新研究:需持续监控蝙蝠 中华菊头蝠是SARS病毒的宿主

　　中华菊头蝠ACE2变体对SARS相关冠状病毒感染表现出的不同敏感性

　　为了评估不同的中华菊头蝠ACE2分子是否会影响SARS病毒和蝙蝠SARS相关冠状病毒的进入，研究者在HeLa细胞中瞬时表达了中华菊头蝠的ACE2的变体，并测试了携带不同刺突蛋白的SARS病毒伪型或蝙蝠SARS相关冠状病毒的进入效率。

　　4株蝙蝠SARS相关冠状病毒按照S1序列可分为4个基因型。简单地说，与SARS病毒的刺突蛋白相比，SARS相关病毒RsWIV1的RBD与SARS病毒具有氨基酸高度同一性；RsWIV16是SARS病毒的近亲，在NTD和RBD均表现氨基酸高相似；Rs4231在NTD上与SARS病毒有着高度的氨基酸相似度；而RsSHC014在NTD和RBD区域与SARS病毒均有差异。

　　与之前的研究结果类似：所有四株具有相同基因组背景但不同刺突蛋白的蝙蝠SARS相关冠状病毒毒株，都可以利用人类ACE2进行相似水平的复制。

　　然而，它们在如何利用中华菊头蝠ACE2方面存在一些差异。所有测试病毒都能有效利用等位基因1、2、4、5进入。具有相同RBD的RsWIV1和RsWIV16则不能使用来自广东的等位基因6(样本ID 1434)。具有相同RBD的Rs4231和RsSHC014不能分别使用来自云南和广东的等位基因7(样本ID 3357)和等位基因8(样本ID 1438)。SARS病毒BJ01与WIV1和WIV16的RBD有很高的相似性，能够在假型感染实验中使用与Rs4231和RsSHC014相同的蝙蝠ACE2等位基因。

　　这些结果表明，病毒进入细胞都受到刺突RBD和中华菊头蝠 ACE2变异体的影响。

　　蝙蝠ACE2残基突变会影响其与SARS相关冠状病毒RBD的结合亲和力

　　为进一步了解SARS病毒和SARS相关冠状病毒对ACE2使用能力不同，研究者表达了冠状病毒BJ01、RsWIV1、RsWIV1、RsSHC014的RBD，和3个中华菊头蝠的ACE2，分别是等位基因6(样本1434)，等位基因7(样本3357)和等位基因2(样本5720)。

　　随后，研究者测试它们之间的亲和力。阳性对照为SARS病毒BJ01的RBD 与人ACE2，阴性对照为SARS病毒RsWIV1的RBD 与人DPP4。实时分析表明，基于平衡解离常数KD，不同RBD与ACE2的结合亲和力不同。

　　与病毒感染实验结果一致，发现1434ACE2(等位基因6)与RsSHC014和BJ01结合，而与RsWIV1的RBD不结合；研究还发现3357ACE2(等位基因7)与RsWIV1结合，但不与RsSHC014和BJ01的RBD结合；5720ACE2(等位基因2)被发现能结合所有测试的RBD。所有被测试的RBD都与人类或蝙蝠ACE2具有很高的结合亲和力。然而，与两种蝙蝠SARS相关冠状病毒的RBD相比，它对中华菊头蝠ACE2的结合亲和力较低。

　　这些结果表明，刺突RBD与ACE2的结合亲和力影响病毒的感染能力。

　　SARS相关冠状病毒RBDs与中华菊头蝠ACE2s相互作用的结构模型

　　4个蝙蝠SARS相关冠状病毒的刺突蛋白大小相同，与SARS-CoV的氨基酸同源性超过90%，表明这些蛋白具有228个相似的结构。在本研究中，他们使用中华菊头蝠ACE2 3357（等位基因7)构建了蝙蝠SARS相关冠状病毒RsSHC014 RBD的结构复杂模型，并用中华菊头蝠ACE2 1434(等位基因6)构建了蝙蝠SARS相关冠状病毒RsWIV1 RBD的结构复杂模型。

　　这与SARS-CoV RBD与人类ACE2的结合亲和实验结果一致。与SARS-CoV RBD和人类ACE2界面的接触残基相比，可以观察到ACE2上的两个病毒病毒结合热点(hotspot hotspot Lys31和Lys353分别由Glu35和Asp38组成的盐桥)或附近的变化。如前所述，这两个热点隐藏在疏水环境中。它们为病毒-受体结合相互作用提供了大量的能量，并填补了结合界面上疏水性叠加238相互作用的关键空隙。

　　与人ACE2相比，中华菊头蝠ACE2-3357的两个主要残留变化是E35K和Y41H。E35K与RsSHC014 RBD中K31和Arg479的盐桥断裂，可能影响它们之间的结合亲和力。41位置的组氨酸可能会削弱K353- d38盐桥的支撑力，因为组氨酸比酪氨酸的疏水性更弱，导致其与BJ01 RBD的结合亲和力降低。因此，BJ01和RsSHC014 RBD与中华菊头蝠ACE2 -3357的结合亲和力较低。

　　在中华菊头蝠ACE2-1434中，位置31发现了苏氨酸，这与人类ACE2的这个位置不同，人类的是赖氨酸。虽然K31T的变化导致其不能与Glu35形成盐桥，但BJ01的RBD c中的Tyr442可以与之形成氢键。但RsWIV1 RBD中位于442的丝氨酸则不具备这种功能。

　　此外，RsSHC014含有一个位于479的精氨酸，Thr31不能与Glu35形成盐桥，使Glu35可以与Arg479形成盐桥，但RsWIV1中的RBD残基Asn479可能会导致其失去这一能力。因此，BJ01和RsSHC014 RBD可以与中华菊头蝠ACE2 -1434结合，但RsWIV1RBD无法与中华菊头蝠的ACE2 -1434结合。

　　本研究中所有的中华菊头蝠 ACE2在82的位置都包含一个天冬酰胺，而人类ACE2在此位置则是蛋氨酸。M82N的变化引入了一个不利的亲水残基，削弱了热点31周围的疏水网络。此外，Asn82引入了一个糖基化位点，就像在大鼠ACE2中一样，导致其不能有效支持SARS-CoV感染；ACE2在82位置上的聚糖可能导致空间干扰病毒RBD结合。

　　因此，M82N可能对SARS-CoV及SARS相关冠状病毒RBD与中华菊头蝠ACE2s的相互作用有显著影响。如前所述，RBD的487残基与ACE2上的热点353相互作用。RsWIV1 RBD中含有Asn487, Asn487的极性侧链可能与ACE2中Lys353残基的脂肪族部分发生不利的相互作用，影响K353与D38的热点相互作用。

　　此外，RsSHC014 RBD在位置487含有一个丙氨酸；Ala 487的小侧链不支持热点353的结构。因此，RsWIV1及RsSHC014 RBD与人类ACE2的结合亲和力均低于BJ01，但与人类ACE2的结合亲和力均高于中华菊头蝠ACE2，这与病毒感染和结合实验结果高度相符。